PAN informacje

W diagnostyce medycznej znaczenie badań kodu genetycznego rośnie z dnia na dzień, a współczesna biologia molekularna nie mogłaby bez nich funkcjonować. Obecne techniki analizy DNA trudno jednak nazwać doskonałymi. Podczas prac nad rekordowo szybkim przyrządem do badań genetycznych firma Curiosity Diagnostics, spin-off warszawskiego Instytutu Chemii Fizycznej PAN akcelerowany w grupie Scope Fluidics, opracowała nowy sposób analizy DNA, łączący kluczowe zalety dwóch obecnie najczęściej stosowanych metod.

www.pixabay.com

Diagnostyka molekularna odgrywa coraz większą rolę w dzisiejszej  medycynie: w wykrywaniu chorób genetycznych, monitorowaniu skuteczności  terapii antynowotworowych, w walce z agresywnymi infekcjami  bakteryjnymi, gdzie wczesna identyfikacja gatunku bakterii zagrażającej  pacjentowi może zadecydować o jego życiu. W należącej do grupy Scope  Fluidics firmie Curiosity Diagnostics (CD) opracowano – przy udziale  Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) w Warszawie  – nową technikę analizy DNA: synergiczny PCR (sPCR). Metoda, szczegółowo  opisana we wspólnej publikacji naukowców CD i IChF PAN w znanym  czasopiśmie naukowym „Scientific Reports”, łączy zalety dwóch obecnie  najpopularniejszych technik analizy kodu genetycznego i może być  zaimplementowana na powszechnie dostępnej aparaturze.

„Zaproponowana przez nas technika badania DNA narodziła się podczas  prac nad nowatorskim przyrządem analitycznym PCR|ONE, za pomocą którego  badanie kodu genetycznego można zrealizować nawet w siedem minut. To  czas ponaddziesięciokrotnie krótszy od wymaganego w klasycznych  rozwiązaniach”, mówi prof. dr hab. Piotr Garstecki (IChF PAN, CD).

Próbki przekazywane do badań DNA zwykle zawierają tak mało materiału  genetycznego, że jego analiza za pomocą typowych technik laboratoryjnych  nie byłaby możliwa. Po oczyszczeniu próbki z zanieczyszczeń pierwszym  krokiem jest więc zwiększenie ilości materiału genetycznego, nierzadko  nawet miliard razy. Stosuje się w tym celu łańcuchową reakcję polimerazy  (Polymerase Chain Reaction, PCR).

Reakcja PCR polega na cyklicznym ogrzewaniu i schładzaniu roztworu  zawierającego powielany materiał genetyczny oraz odpowiednie reagenty: polimerazę (czyli enzym katalizujący reakcję syntezy DNA), nukleotydy  niezbędne do budowy nici DNA oraz startery, czyli krótkie fragmenty DNA  zdolne do przyłączania się do początku i końca namnażanego fragmentu  kodu (np. konkretnego genu). Każdy cykl reakcji PCR składa się z dwóch  faz: podgrzewania i schładzania. W pierwszej fazie, w temperaturze ok.  95 stopni Celsjusza, pękają mostki wodorowe i dotychczas dwuniciowy  łańcuch DNA rozdziela się na dwie pojedyncze nici. W fazie chłodnej, w  temperaturze ok. 50 stopni, startery z roztworu przyłączają się do  odpowiednich miejsc na niciach, po czym polimeraza dobudowuje między  nimi nić komplementarną. Po zakończeniu każdego cyklu dwuniciowych  fragmentów DNA jest (w idealnych warunkach) dwukrotnie więcej niż na  początku.

Reakcję PCR stosuje sę zarówno do wykrywania określonych fragmentów  kodu genetycznego, jak też do szacowania pierwotnej ilości materiału  genetycznego. Pomiary ilościowe przeprowadza się najczęściej za pomocą (analogowej) techniki znanej jako real-time PCR. Próbkę poddaje się  namnażaniu i w kolejnych cyklach sprawdza się ilość DNA za pomocą  fluorescencyjnych barwników. Gdy intensywność zmian przekroczy ustalony  próg, na podstawie przeprowadzonej liczby cykli szacuje się pierwotną  ilość materiału genetycznego. Technika analogowego PCR jest stosunkowo  prosta, jednak z uwagi na wrażliwość reakcji PCR na nawet pojedyncze  cząsteczki zanieczyszczeń wymaga uważnego, ciągłego kalibrowania.

Inna mteoda to cyfrowy PCR. Próbkę dzieli się na dziesiątki lub setki  tysięcy, a nierzadko nawet na miliony jednakowych co do objętości  części. Następnie w każdej części przeprowadza się procedurę powielania  materiału genetycznego i sprawdza, czy pojawia się ustalona zmiana. Ponieważ podczas dzielenia próbki cząsteczki DNA trafią tylko do  niektórych podobjętości, zmiana nie wystąpi wszędzie. Pierwotną ilość  DNA można więc oszacować na podstawie liczby zarejestrowanych sygnałów.  Zaletą techniki cyfrowej jest brak konieczności kalibrowania aparatury.  Z uwagi na wymóg równoległego prowadzenia ogromnej liczby reakcji,  sprzęt do badań jest jednak dość drogi i w laboratoriach występuje  znacznie rzadziej niż aparatura do analogowego PCR.

Synergistyczny PCR, technika zaproponowana przez CD i IChF PAN, łączy  najważniejsze zalety metod analogowych i cyfrowych. Aby otrzymać  wiarygodne pomiary, próbkę wystarczy rozcieńczyć na zaledwie  kilkanaście, najwyżej kilkadziesiąt części. Tak zaprojektowana metoda  nie wymaga kalibrowania.

„Niewielka liczba podobjętości, charakterystyczna dla naszej techniki,  ma konkretne przełożenie praktyczne. Oznacza bowiem, że do  przeprowadzenia analizy wystarczą standardowe płytki wielodołkowe,  wykorzystywane w popularnych urządzeniach do analogowego PCR”, podkreśla  Paweł Dębski, doktorant IChF PAN, który rozwijał metodę sPCR w Curiosity  Diagnostics.

Z uwagi na małą liczbę podziałów próbki, technika sPCR jest łatwiejsza  do przeprowadzenia i nieco szybsza niż odmiany cyfrowe. W porównaniu do  technik analogowych wymaga jednak większej ilości reagentów. Zdaniem  warszawskich naukowców, z tego powodu nie zastąpi odmiany analogowej.
 Może być jednak jej cennym uzupełnieniem, ponieważ jako niewymagająca  kalibracji pozwoli laborantom samodzielnie i regularnie sprawdzać  poprawność pomiarów analogowych.

„Opracowana przez nas technika badania DNA została opatentowana. Chcemy  jednak podkreślić swobodę jej używania w celach niekomercyjnych. A  ponieważ korzysta ona z typowej, popularnej aparatury do badań  genetycznych, żeby zacząć ją zastosować wystarczy sięgnąć po nasz  artykuł”, zaznacza prof. Garstecki.

Technika sPCR powstała jako integralny składnik PCR|ONE, innowacyjnego  urządzenia grupy Scope Fluidics, przeznaczonego do szybkich analiz DNA. W standardowych aparatach PCR do podgrzewania i schładzania materiału  genetycznego wykorzystuje się stosunkowo wolną dyfuzję ciepła między  próbką a stykającym się z nią dużym blokiem naprzemiennie podgrzewanego  bądź schładzanego materiału. W PCR|ONE do błyskawicznego podgrzania  próbki używa się promieniowania podczerwonego. Zmodyfikowano także  mechanizm dyfuzyjnego schładzania: stosowany w tym celu blok jest  mniejszy niż w tradycyjnych przyrządach i utrzymywany w stałej, ściśle  kontrolowanej temperaturze. W wyniku wprowadzonych udoskonaleń  technicznych i analitycznych, testowane obecnie prototypowe egzemplarze  PCR|ONE są w stanie zakończyć badanie DNA w czasie poniżej kwadransa, a  samą reakcję PCR realizują w zaledwie siedem minut. Pierwsze egzemplarze  PCR|ONE trafią na rynek najprawdopodobniej w ciągu 2-3 lat.

Źródło: Instytut Chemii Fizycznej PAN