Nowe leki po konsumpcji tlenu

ichf czoloPotencjalnie każda mikrokropla płynąca kanalikami układu mikroprzepływowego może pracować jako odrębny bioreaktor

W przyszłości testy nowych leków na bakteriach będzie można przeprowadzać wydajniej, za pomocą układów mikroprzepływowych. Każda z tysięcy przemieszczających się mikrokanalikami kropelek może bowiem pełnić rolę odrębnego inkubatora. Dotychczas nie istniała jednak szybka i dokładna metoda oceny warunków tlenowych panujących w poszczególnych mikrokroplach. Tę kluczową przeszkodę pokonali naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej PAN.
 
Nie rzędy wielkich zbiorników przemysłowych, nie półki zastawione probówkami i zlewkami. Przyszłość chemii i biologii jest dla oka ledwie widoczna: to setki i tysiące mikrokropel, sunących cieniutkimi kanalikami układów mikroprzepływowych. Na świecie trwa wyścig ku technologiom pozwalającym prowadzić w mikrokroplach kontrolowane doświadczenia chemiczne i biologiczne. W Instytucie Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) w Warszawie pierwszy raz zademonstrowano metodę zdalnej, a jednocześnie szybkiej i precyzyjnej oceny zużycia tlenu przez drobnoustroje żyjące w poszczególnych mikrokroplach.
 
– Układy do hodowania bakterii w mikrokroplach mają szansę zrewolucjonizować prace nad nowymi antybiotykami czy badania nad mechanizmami odpowiedzialnymi za nabywanie lekooporności przez bakterie. W jednym, małym układzie mikroprzepływowym można bowiem zmieścić kilkaset, a nawet kilka tysięcy mikrokropel – i w każdej realizować inny eksperyment, np. z różnymi gatunkami drobnoustrojów i przy różnych stężeniach antybiotyku w każdej kropli – opisuje prof. dr hab. Piotr Garstecki (IChF PAN), po czym wyjaśnia: – Żeby takie badania były możliwe, bakteriom trzeba zapewnić warunki do rozwoju nawet przez kilka tygodni. Niezwykle ważna staje się więc wiedza o przepływie tlenu do kropel i tempie jego konsumpcji przez mikroorganizmy. W naszym najnowszym układzie demonstrujemy sposób na odczytywanie tej kluczowej informacji.
 
Bioreaktory przyszłości to wodne kropelki z pożywką, unoszone w niemieszającej się z nimi cieczy nośnej (zwykle jest nią olej). W kanaliku układu mikroprzepływowego każda kropelka jest dłuższa niż szersza i niemal całkowicie wypełnia jego światło; tak dobrane rozmiary gwarantują, że krople nie zamienią się w kanale miejscami i przez cały czas trwania eksperymentu można je będzie bez problemów identyfikować. Jednocześnie między każdą mikrokroplą a ściankami kanału trzeba cały czas zapewnić obecność cienkiej warstwy oleju. Bez niej bakterie miałyby bezpośredni kontakt ze ściankami kanału, mogłyby się na nich osadzać i przenosić z kropli do kropli. Niestety, gdy mikrokropla jest nieruchoma, z czasem wypycha olej odgradzający ją od ścianek, co grozi ich kontaminacją. To dlatego krople muszą być utrzymywane w ciągłym ruchu – nawet tygodniami. Rozwijające się bakterie potrzebują pożywki, a z ich otoczenia należy w odpowiednim tempie usuwać produkty przemiany materii. Informacja o przebiegu konsumpcji tlenu przez bakterie w poszczególnych kroplach ma więc kluczowe znaczenie dla działania mikrobioreaktorów.
 
– Od razu widać, w czym tkwi problem. W każdej z kilkuset znajdujących się w ruchu kropelek trzeba przeprowadzać pomiary z częstotliwością odpowiadającą częstotliwości podziałów bakterii lub większą, w praktyce przynajmniej raz na kwadrans. Dodatkowo pomiar nie może się wiązać z ingerencją w mikrokrople – mówi doktorant Michał Horka (IChF PAN), jeden ze współautorów publikacji w czasopiśmie „Analytical Chemistry”.

ichf 01

Z pomocą warszawskim naukowcom pospieszyli chemicy z austriackiego Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry przy Graz University of Technology. Dostarczyli oni polimerowe nanocząstki z fosforyzującym barwnikiem, po pobudzeniu do świecenia emitujące światło tym dłużej, im większe jest stężenie tlenu w otaczającym je roztworze (nanocząstki te poddano w IChF PAN testom na bakteriach w celu ustalenia ich ewentualnej toksyczności, której nie stwierdzono). Badania nad monitorowaniem zużycia tlenu w mikrokroplach rozpoczynano od przygotowania roztworu wodnego z bakteriami, pożywką i odpowiednią ilością nanocząstek. Mieszaninę wstrzykiwano do układu mikroprzepływowego zbudowanego z wężyków połączonych za pomocą teflonowych kostek z odpowiednio ukształtowanymi kanalikami. Pierwsza kostka formowała krople o objętości ok. 4 mikrolitrów, które kierowano do nawiniętego na szpulę wężyka inkubacyjnego. W połowie jego długości umieszczono drugą kostkę, z detektorami do pomiaru tlenu i absorbancji.
 
– W części inkubacyjnej w jednej fazie cyklu kropelki płynęły w jedną stronę, w drugiej – w drugą, sterowane elektronicznie za pomocą odpowiednich zaworów elektromagnetycznych. Wszystko to wygląda na pozór dość prosto, ale w praktyce jednym z największych wyzwań było zapewnienie tak gładkiego przejścia między kostką detekcyjną a wężykiem, aby na połączeniach nie dochodziło do zanieczyszczenia bakteriami – wyjaśnia doktorant Horka.
 
W trakcie podróży przez kostkę detekcyjną mikrokropelki przepływały pod czujnikiem optycznym mierzącym tzw. gęstość optyczną, czyli standardowy parametr służący do oceny liczby komórek (im więcej bakterii w kropli, tym mniej światła przez nią przechodzi). Z kolei pomiar czasu świecenia nanocząstek, pozwalający ocenić stężenie tlenu w mikrokropli, realizowano za pomocą detektora optycznego Piccolo2, dostarczonego przez grupę austriacką. Detektor ten, wyglądem przypominający dużego pendrajwa, był podłączany bezpośrednio do złącza USB w komputerze sterującym. Zestawiając informacje z obu czujników badacze z IChF PAN wykazali, że skonstruowany przez nich układ mikroprzepływowy pozwala regularnie i szybko monitorować aktywność metaboliczną bakterii w poszczególnych mikrokroplach.
 
– Nasze testy przeprowadziliśmy zarówno z bakteriami pływającymi w wodzie pojedynczo – tak zachowują się popularne bakterie Escherichia coli – jak i z mającymi tendencję do zlepiania się w grudki – jak to jest w przypadku prątków gruźlicy czy należących do tej samej rodziny, a badanych przez nas Mycobacterium smegmatis. Ocena tempa konsumpcji tlenu przez oba gatunki drobnoustrojów okazała się nie tylko możliwa, ale i wiarygodna – podkreśla doktorant Artur Ruszczak (IChF PAN).
 
Wyniki badań, finansowanych z europejskich grantów ERC Starting Grant (strona polska) i Marii Skłodowskiej-Curie (strona austriacka), to ważny etap w procesie budowy w pełni funkcjonalnych układów mikroprzepływowych do prowadzenia wielotygodniowych eksperymentów biologicznych. Układ do hodowli bakterii w mikrokroplach powstał w IChF PAN już kilka lat temu, był jednak wykonany w płytce poliwęglanowej. Maksymalne rozmiary płytki nie przekraczały tu 10 cm, co znacznie ograniczało liczbę kropel; na dodatek wskutek oddziaływania z poliwęglanem już po czterech dniach dochodziło do zanieczyszczenia kanałów bakteriami. Układy z kostek teflonowych i wężyków byłyby pozbawione tych wad i nadawałyby się już do praktycznych zastosowań.

ichf 02Fragment układu mikroprzepływowego zbudowanego z wężyków i kostek teflonowych

Źródło: Instytut Chemii Fizycznej PAN
zdjęcia: Grzegorz Krzyżewski/ICHF PAN